| 适用范围 | 试剂 |
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| 使用方法 | 人来源的子宫内膜类器官完全培养基制备 1. 试剂准备：提前将人子宫内膜类器官基础培养基和人子宫内膜类器官添加物从-20℃取出， 冰上放至融化。 2. 完全培养基配制：将人子宫内膜类器官培养基添加物全部转移到基础培养基中，混合均匀。 3. 原代标本培养：取 10 mL 配置好的完全培养基，加入 100 μL Primary Enhancer，即可 使用。 4. 维持培养：对于非原代标本的培养，使用人子宫内膜类器官完全培养基即可。 人来源的子宫内膜类器官类器官构建： 1. 将组织标本转移到 3.5 cm 培养皿中，培养皿置于冰盒上，加入 2 mL DPBS-PS，清除多 余组织。 2. 将标本使用 DPBS-PS 进行清洗，反复涮洗至清洗液澄清，约 5 - 10 次。去除清洗液，加 入组织消化液Ⅰ约 200 μL。 3. 清洗完成后将标本剪切至 0.5 - 1 mm3 的大小，将切碎的组织转移至 15 mL 的离心管中， 加入 4 mL 组织消化液Ⅰ，37℃摇床消化 30 - 40 min，每隔 15 min 进行观察是否有大 片的细胞漏出，该步骤的消化时间可能会根据标本的情况进行调整。 4. 消化液Ⅰ消化结束后，加入 8 mL DPBS-PS 终止消化，300 g，离心 5 min，弃上清。 5. 加入 2 mL 组织消化液Ⅱ，37℃，摇床消化 10 - 15 min。消化结束后，加入 4 mL DPBS-PS 终止消化，300 g，离心 5 min，收集细胞。 6. 弃上清，加入 2 mL DPBS-PS 对细胞进行重悬，使用 2 mL 抗粘附液预先湿润一个 100 μm 的细胞筛网，将细胞悬液使用该细胞筛网过滤，将滤出的滤液进行离心，300 g，5 min。 7. （可选步骤）去上清，如含较多红细胞（细胞沉淀呈现红色），加入红细胞裂解液进行裂 红（具体实验方法参考产品说明书）。 8. 细胞计数，通过自动细胞计数仪或者手动计数板计出细胞团的个数，按照 1-2*104 1. 细胞团/mL 的密度重悬于基质胶（BME 或 Matrigel）中（接种密度仅供参考，可按照实 验需求进行调整）。将基质胶重悬后的细胞接种至 37℃预热的细胞培养板中，注意枪尖 不要接种至培养板的底部，胶滴应接种于培养孔的中心位置，若是 24 孔板，则每孔可接 种 50 μL。 9. 将接种好的培养板放置在 37℃下静置 5 min 后，倒置培养板静置 25 min，向每个孔中 轻轻地加入 500 μL 于 37℃预热的人子宫内膜类器官完全培养基。 10.将无菌 DPBS-PS 加至其它未接种液滴的孔中，以保持培养时的湿度，将培养板的盖子盖 上，并在 37℃和 5％CO2 下进行培养。 11.镜下观察类器官的培养情况，适时进行换液或传代（一般建议每 2-3 天进行全换液或半换 液）。一般在接种 3-4 天后，可观测到类器官形成，在传代前，确保大部分类器官的大小 大于 100 μm。 人来源的子宫内膜类器官传代： 1. 将培养类器官的 24 孔板取出，用移液器去除培养基，加入 2 mL TrypLE，使用 1 mL 枪 头将胶滴吹散（可根据类器官量适量增加 TrypLE 的体积）。室温消化 5 – 8 min，或 37℃培养箱消化 5 min（避免消化过度，影响类器官生长）。 2. 将消化后的类器官悬液转入 6 mL 预冷的 DPBS-PS 中，可润洗培养孔（需回收），保证 培养孔中的类器官都被收集起来。300 g，离心 5min，去上清，收集类器官。 3. 细胞计数：将离心收集的细胞沉淀重悬于 1 mL DPBS-PS 中，通过自动细胞计数板或者 手动计数板计出细胞团的个数，一个胶滴大约需要 200 - 500 个细胞团（约 5 – 10 万个 细胞）。计数后，300 g， 离心 5 min，去上清，收集类器官。 4. 将获取的细胞沉淀根据计数结果重悬于基质胶中。吸取 50 μL，并加入到提前预热的 24 孔板（提前预热半小时）的中心部位。（不要将类器官接种到最外侧的孔中。） 5. 将接种好的培养板放置在 37℃下静置 5 min 后，倒置培养板静置 25 min，以待基质胶 倒置凝固。 6. 使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入 500 μL 于 37℃预热的类器官完全培养基， 请勿将培养基直接加到胶滴上。将适量 DPBS-PS 加至其它未接种液滴的孔中，以保持培 养时的湿度。 7. 盖上培养板板盖，并在 37℃和 5％CO2 下进行培养。并每 2 - 4 天进行一次培养基换液， 观察生长情况，并进行拍照记录，直至下次传代。 人来源的子宫内膜类器官冻存： 1. 观察类器官生长情况，当类器官活性良好，每毫升活细胞数不低于 5*105 个时，即可进行 冻存，类器官每管冻存细胞量约为 5*105 个，若细胞量较多时应注意分管冻存。 2. 小心吸走培养孔中的培养基，加入适量 TrypLE，吹散胶滴，37℃培养箱，孵育 3 min， 显微镜下观察类器官消化情况，待类器官消化至 40-60 μm 大小时，即可加入 2-3 倍消 化液体积的 DPBS-PS 终止消化，300 g，离心 5 min，弃上清；加入 3 mL DPBS-PS 重 悬细胞，300 g，离心 5min，弃上清。 3. 加入类器官冻存液重悬沉淀，混合均匀后分装至标记好的冻存管中，每管 1 mL；将冻存 管置于程序降温盒中，进行梯度降温：4℃（20 min），-20℃（2 h），-80℃（过夜）， 最后转移至液氮罐。 |
| 注意事项 | 1. 本产品使用过程中应注意无菌操作，避免污染。 2. 本产品仅适用于新鲜获取或在组织保存液中保存 24h 内的新鲜标本。 3. 本产品培养结果会受到标本质量、培养条件等因素影响，同时也受到技术员操作习惯、操 作环境以及当前细胞生物学技术局限性等限制，因此可能会存在培养失败的情况。 4. 类器官完全培养基中不含有抗生素成分，请根据实验需求自行添加，推荐工作浓度为 1%。 5. 建议进行适当分装，-20℃储存，开封后，4℃保存使用，并于 2 周内用完，避免反复冻 融。 |
| 声明 | 仅用于科研使用，不能用于临床诊断和治疗。 |
| 保存条件 | 人子宫内膜类器官基础培养基：-20°C，12 个月；4°C，3个月 人子宫内膜类器官培养基添加物:-20°C，12 个月 |
