| 适用范围 | BDBIO 小鼠小肠类器官适用于细胞治疗、药物研发、基因工程、免疫研究、组织再生等领域 的研究。 |
|---|---|
| 使用方法 | 小鼠来源的小肠类器官构建 1. 使用镊子去除肠道外部的肠系膜、血管和脂肪，将肠段放入 10cm 培养皿中，培养皿置于 冰盒上，加入 2mL 预冷 DPBS-PS，使用 DPBS-PS 轻轻冲洗肠段。用剪刀将肠段纵向切 开，肠腔朝上打开，使用预冷 DPBS-PS 反复轻轻洗涤肠段至清洗液澄清。（如新鲜标本 无法立即处理，组织标本应浸泡在组织保存液中，建议使用 BDBIO 组织运输保存液 （#3D400-100），冰上运输尽快处理。） 2. 准备装有 15mL 预冷 DPBS-PS 的 50mL 离心管，用镊子夹住肠段一端，悬挂于离心管口， 将肠段剪成 2-5mm 小段，使肠段落入管内液体中。 3. 使用 10mL 移液管轻轻上下吹打肠道片段三次，静置后轻轻吸出上清液，加入 15mL 预 冷 DPBS-PS。重复上述步骤 15-20 次，直至上清液澄清。 4. 消化液配制：准备 50mL DPBS-PS，加入 100μL 肠类器官组织消化液（500X），现配 现用。 5. 清洗后的组织 200g，离心 3min，弃上清，向组织沉淀中加入肠类器官组织消化液 25mL（1x)，摇床室温消化 15-20min，取部分于显微镜下观察肠隐窝情况。（该步骤的 消化时间可能会根据标本的情况进行调整） 6. 加入 4mL DPBS-PS 终止消化，200g，离心 3min，弃上清，加入 DPBS-PS 重悬。 7. 准备一支装有 70μm 滤网的 50mL 洁净离心管，使用移液管将混悬液通过 70μm 滤网过 滤（可适当倾斜或轻微碰撞过滤器，使其快速过滤），以去除多余的绒毛，收集滤液。丢 弃滤网并将滤液放置于冰上，标记为“馏分 1”。重复上述步骤，将组织片段重悬于 10mL 预冷 DPBS-PS 中，滤网过滤后获得馏分 2-4，放置于冰上。 8. 在 2–8℃下将各馏分 290g，离心 5min，弃上清液，将沉淀保留在每个管中。将各试管 中的沉淀重悬于 10mL 预冷 DPBS-PS 中，分别转移到干净的 15mL 离心管中，并标记对 应的馏分序号，在 2–8℃下 200g，离心 3min，弃上清，保留肠隐窝沉淀。 9. 用 1mL DPBS-PS 重悬隐窝沉淀，取混悬液镜下观察，计数 10μl 样本中隐窝数量后，离 心管于 200g，离心 5min，弃上清。使用类器官培养基将隐窝密度重悬，按照 0.8-2*104 个/mL 的密度重悬于基质胶（BME 或 Matrigel）中（接种密度仅供参考，可按照实验需 求进行调整）。将基质胶重悬后的隐窝接种至 37℃预热的细胞培养板中，注意枪尖不要 接触至培养板的底部，胶滴应接种于培养孔的中心位置，若是 24 板，则每孔可接种 50μ L。 10.将接种好的培养板放置在 37℃下静置 5min 后，倒置培养板静置 25min，以待基质胶倒 置凝固。向每个孔中轻轻地加入 500μL 于 37℃预热的小鼠小肠类器官完全培养基。 11.将无菌 DPBS-PS 加至其它未接种液滴的孔中，以保持培养时的湿度，将培养板的盖子盖 上，并在 37℃和 5％CO2 下进行培养。 12.镜下观察类器官的培养情况，3h 后可观察隐窝是否存活。建议适时进行换液或传代（一 般建议每 2-3 天进行全换液或半换液）。一般在接种 2-4 天开始出芽，5-7 天变成多裂状。 在传代前，确保大部分类器官的大小大于 100μm。 小鼠来源的小肠类器官传代 1. 将培养类器官的 24 孔板取出，用移液器去除培养基，加入 2mL TrypLE，使用 1mL 枪头 将胶滴吹散。可根据类器官量适量增加 TrypLE 的体积）室温消化 5-8min，或 37℃培养 箱消化 5min（避免消化过度，影响类器官生长）。 2. 将消化后的类器官悬液转入 6mL 预冷的 DPBS-PS 中，可润洗培养孔（需回收），保证 培养孔中的类器官都被收集起来。290g，离心 5min，弃上清，收集类器官。 3. 隐窝计数：将离心收集的类器官沉淀重悬于 1mL DPBS-PS 中，通过自动细胞计数板或者 手动计数板计出隐窝的个数，一个胶滴大约需要 200-500 隐窝(若隐窝状态良好可进行 1:3 传代，若状态较差可进行 1:1 传代)。计数后，290g，离心 5min，弃上清，收集类器 官。 4. 将获取的隐窝沉淀根据计数结果重悬于基质胶（Matrigel）中。吸取 50μL，并加入到提 前预热的 24 孔板（提前预热半小时）的中心部位。（不要将类器官接种到最外侧的孔 中。） 5. 将接种好的培养板放置在 37℃下静置 5min 后，倒置培养板静置 25min，以待基质胶倒 置凝固。 6. 使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入 500μL 于 37℃预热的类器官完全培养基， 请勿将培养基直接加到胶滴上。将适量 DPBS-PS 加至其它未接种液滴的孔中，以保持培 养时的湿度。 7. 盖上培养板板盖，并在 37℃和 5％CO2 下进行培养。并每 2–4 天进行一次培养基换液， 观察生长情况，并进行拍照记录，直至下次传代。 小鼠来源的小肠类器官冻存 1. 观察类器官生长情况，当类器官活性良好，类器官大小大于 200μM，每个胶滴内隐窝数 不低于 150 个时，即可进行冻存，类器官冻存量约为 500 个/管，若类器官数量较多时应 注意分管冻存。 2. 小心吸走培养孔中的培养基，加入适量 TrypLE，吹散胶滴，37℃培养箱，孵育 3min， 显微镜下观察类器官消化情况，待类器官消化至 40-60μm 大小时，即可加入 2-3 倍消化 液体积 DPBS-PS 终止消化，200g，离心 5min，弃上清；加入 3mL DPBS-PS 重悬， 200g，离心 5min，弃上清。 3. 加入类器官冻存液重悬沉淀，混合均匀后分装至标记好的冻存管中，每管 1mL；将冻存 管置于程序降温盒中，进行梯度降温：4℃（20min），-20℃（2h），-80℃（过夜）， 最后转移至液氮罐。 |
| 注意事项 | 1. 本产品仅供科研使用，使用前请仔细阅读本说明书。 2. 本产品培养结果会受到标本质量、培养条件等因素影响，同时也受到技术员操作习惯、操 作环境以及当前细胞生物学技术局限性等限制，因此可能会存在培养失败的情况。 3. 所有接触类器官的移液管、枪头等类器官培养耗材均需进行润洗，以免在传代过程中出现 样本的流失，推荐使用 BOBIO 抗粘附液效果更佳。 |
| 声明 | 仅用于科研使用，不能用于临床诊断和治疗。 |
| 保存条件 | |
| 外观 | |
| 浓度 | |
| 有效期 |
浙江百迪生物科技有限公司（简称“百迪科技”）成立于 2019 年，公司聚集于生物细胞培养领域。2023 年新百迪全面扩容，目前是国内首家集细胞培养区域三大产品管线——细胞、细胞培养试剂、耗材于一体的全领域产品生产制造商。百迪坚持自研自产，从源头开始，重视细节，严控质量，目标成为行业领先的卓越产品生产和服务商。
了解百迪动态，掌握最新科技资讯。如果您对我们的产品和服务感兴趣，或者希望了 解更多信息，请随时联系我们的客户服务团队。 我们期待与您合作，一同推动科研的辉煌未来。
400-601-2023
sales@biocode.cn
400-601-2023
sales@biocode.cn
