| 适用范围 | 适用于猪小肠组织来源类器官的构建、维持培养及传代扩增。 |
|---|---|
| 使用方法 | 猪小肠类器官完全培养基制备： 1. 提前将猪小肠类器官基础培养基和猪小肠类器官添加物从-20℃取出，冰上放至融化。 2. 将猪小肠类器官添加物全部转移到基础培养基中，混合均匀，即为猪小肠类器官完全培养 基。 3. 对于原代标本的培养，可以取 10mL 配置好的完全培养基，加入 100μL Primary Enhancer，即可使用。 4. 对于非原代标本的培养，使用猪小肠类器官完全培养基即可。 猪来源小肠类器官构建： 1. 使用镊子去除肠道外部的肠系膜、血管和脂肪，将肠段放入10cm培养皿中，培养皿置于 冰盒上，加入2mL预冷DPBS-PS，使用DPBS-PS 轻轻冲洗肠段。用剪刀将肠段纵向切开， 肠腔朝上打开，使用预冷DPBS-PS反复轻轻洗涤肠段至清洗液澄清。 如新鲜标本无法立即处理，组织标本应浸泡在组织保存液中，建议使用组织运输保存液， 冰上运输尽快处理。 2. 准备装有15mL预冷DPBS-PS的50mL离心管，用镊子夹住肠段一端，悬挂于离心管口， 将肠段剪成2-5mm小段，使肠段落入管内液体中。 3. 使用10mL移液管轻轻上下吹打肠道片段三次，静置后轻轻吸出上清液，加入15mL预冷 DPBS-PS。重复上述步骤15-20次，直至上清液澄清。 4. 消化液配制：准备50mL DPBS-PS，加入100μL 肠类器官组织消化液（500×），现配现 用。 5. 清洗后的组织200g，离心3min，弃上清，向组织沉淀中加入肠类器官组织消化液25mL （1x)，摇床室温消化15-20min，取部分于显微镜下观察肠隐窝情况。（该步骤的消化时 间可能会根据标本的情况进行调整） 6. 加入4mL DPBS-PS终止消化，200g，离心3min，弃上清，加入DPBS-PS重悬。 7. 准备一支装有70μm滤网的50mL洁净离心管，使用移液管将混悬液通过70μm滤网过滤 （可适当倾斜或轻微碰撞过滤器，使其快速过滤），以去除多余的绒毛，收集滤液。丢弃 滤网并将滤液放置于冰上，标记为“馏分1”。重复上述步骤，将组织片段重悬于10mL 预冷DPBS-PS中，滤网过滤后获得馏分2-4，放置于冰上。 8. 在2-8℃下将各馏分290g，离心5 min，弃上清液，将沉淀保留在每个管中。将各试管中 的沉淀重悬于10 mL预冷DPBS-PS中，分别转移到干净的15mL离心管中，并标记对应的 馏分序号，在2-8℃下200g，离心3 min，弃上清，保留肠隐窝沉淀。 9. 用1mL DPBS-PS 重悬隐窝沉淀，取混悬液镜下观察，计数10μl样本中隐窝数量后，离心 管于200g，离心5min，弃上清。使用类器官培养基将隐窝密度重悬，按照0.8-2*104个 /mL的密度重悬于基质胶（BME或Matrigel）中（接种密度仅供参考，可按照实验需求进 行调整）。将基质胶重悬后的隐窝接种至37℃预热的细胞培养板中，注意枪尖不要接触 至培养板的底部，胶滴应接种于培养孔的中心位置，若是24孔板，则每孔可接种50μL。 10.将接种好的培养板放置在37℃下静置5min后，倒置培养板静置25min，以待基质胶倒置 凝固。向每个孔中轻轻地加入500μL于37℃预热的猪小肠类器官完全培养基。 11.将无菌DPBS-PS加至其它未接种液滴的孔中，以保持培养时的湿度，将培养板的盖子盖 上，并在37℃和5％CO2下进行培养。 12.镜下观察类器官的培养情况，3h后可观察隐窝是否存活。建议适时进行换液或传代（一 般建议每2-3天进行全换液或半换液）。一般在接种2-4 天开始出芽，5-7 天变成多裂状。 在传代前，确保大部分类器官的大小大于100μm。 猪来源小肠类器官传代： 1. 将培养类器官的24孔板取出，用移液器去除培养基，加入2mL TrypLE，使用1mL枪头将 胶滴吹散。可根据类器官量适量增加TrypLE的体积）室温消化5-8 min，或37℃培养箱消化5min（避免消化过度，影响类器官生长）。 2. 将消化后的类器官悬液转入6mL预冷的DPBS-PS中，可润洗培养孔（需回收），保证培 养孔中的类器官都被收集起来。290g，离心5min，弃上清，收集类器官。 3. 隐窝计数：将离心收集的类器官沉淀重悬于1mL DPBS-PS中，通过自动细胞计数板或者 手动计数板计出隐窝的个数，一个胶滴大约需要200-500隐窝(若隐窝状态良好可进行1:3 传代，若状态较差可进行1:1传代)。计数后，290g， 离心5min，弃上清，收集类器官。 4. 将获取的隐窝沉淀根据计数结果重悬于基质胶（Matrigel）中。吸取50μL，并加入到提 前预热的24孔板（提前预热半小时）的中心部位。（不要将类器官接种到最外侧的孔 中） 5. 将接种好的培养板放置在37℃下静置5 min后，倒置培养板静置25 min，以待基质胶倒 置凝固。 6. 使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入500μL于37℃预热的类器官完全培养基，请 勿将培养基直接加到胶滴上。将适量DPBS-PS 加至其它未接种液滴的孔中，以保持培养 时的湿度。 7. 盖上培养板板盖，并在37℃和5％CO2下进行培养。并每2-4天进行一次培养基换液，观 察生长情况，并进行拍照记录，直至下次传代。 注：所有接触类器官的移液管、枪头等类器官培养耗材均需进行润洗，以免在传代过程中 出现样本的流失，使用抗粘附液效果更佳。 猪来源小肠类器官冻存： 1. 观察类器官生长情况，当类器官活性良好，类器官大小大于200μM，每个胶滴内隐窝数 不低于150个时，即可进行冻存，类器官冻存量约为500个/管，若类器官数量较多时应注 意分管冻存。 2. 小心吸走培养孔中的培养基，加入适量 TrypLE，吹散胶滴，37℃培养箱，孵育3 min， 显微镜下观察类器官消化情况，待类器官消化至40-60μm大小时，即可加入2-3倍消化液 体积DPBS-PS终止消化，200g，离心5 min，弃上清；加入3mL DPBS-PS重悬，200g， 离心5 min，弃上清。 3. 加入类器官冻存液重悬沉淀，混合均匀后分装至标记好的冻存管中，每管1mL；将冻存管 置于程序降温盒中，进行梯度降温：4℃（20 min），-20℃（2 h），-80℃（过夜）， 最后转移至液氮罐。 |
| 注意事项 | 1. 本产品仅供科研使用，使用前请仔细阅读本说明书。 2. 本产品仅适用于新鲜获取或在组织保存液中保存 24 h 内的新鲜标本。 3. 本产品培养结果会受到标本质量、培养条件等因素影响，同时也受到技术员操作习惯、操 作环境以及当前细胞生物学技术局限性等限制，因此可能会存在培养失败的情况。 4. 类器官完全培养基中不含有抗生素成分，请根据实验需求自行添加。 5. 建议进行适当分装，-20℃储存，开封后，4℃保存使用，并于 2 周内用完，避免反复冻 融。 |
| 声明 | 仅用于科研使用，不能用于临床诊断和治疗。 |
| 保存条件 | ’-20°C，12 个月 |
浙江百迪生物科技有限公司（简称“百迪科技”）成立于 2019 年，公司聚集于生物细胞培养领域。2023 年新百迪全面扩容，目前是国内首家集细胞培养区域三大产品管线——细胞、细胞培养试剂、耗材于一体的全领域产品生产制造商。百迪坚持自研自产，从源头开始，重视细节，严控质量，目标成为行业领先的卓越产品生产和服务商。
了解百迪动态，掌握最新科技资讯。如果您对我们的产品和服务感兴趣，或者希望了 解更多信息，请随时联系我们的客户服务团队。 我们期待与您合作，一同推动科研的辉煌未来。
400-601-2023
sales@biocode.cn
400-601-2023
sales@biocode.cn
