| 适用范围 | 适用于猪肝脏组织来源类器官的构建、维持培养及传代扩增。 |
|---|---|
| 使用方法 | 猪肝类器官完全培养基制备：
1. 试剂准备：提前将猪肝类器官基础培养基和猪肝类器官添加物从-20℃取出，冰上放至融 化。 2. 完全培养基配制：将猪肝类器官培养基添加物全部转移到基础培养基中，混合均匀，即为 猪肝类器官完全培养基。 3. 原代标本培养：取 10mL 配置好的完全培养基，加入 100μL Primary Enhancer，即可使 用。 4. 维持培养：对于非原代标本的培养，使用猪肝类器官完全培养基即可。 猪来源肝类器官构建： 1. 样本处理：将组织标本转移到10cm培养皿中，培养皿置于冰盒上，加入10mL DPBS-PS， 清除多余组织。 如新鲜标本无法立即处理，组织标本应浸泡在组织保存液中，建议使用组织运输保存液， 冰上运输尽快处理。 2. 样本清洗：将标本使用DPBS-PS进行清洗，反复涮洗约5-10次，涮洗至清洗液澄清，去 除清洗液。 3. 消化前样本准备：清洗完成后加入组织消化液Ⅰ约200μL。将标本剪切至0.5-1mm3 的大小，将切碎的组织转移至15 mL的离心管（用抗粘附液预先润湿）中。 4. 消化阶段Ⅰ：加入4mL 组织消化液Ⅰ，37℃摇床消化30-40 min，每隔15 min观察是 否有大量的细胞漏出，该步骤的消化时间可能会根据标本的情况进行调整。当有细胞大 量漏出，且组织块中大部分细胞已经被消化出来时，即可终止消化阶段Ⅰ。 5. 终止消化阶段Ⅰ：加入8mL DPBS-PS终止消化，300g，离心5min，弃上清。 6. 消化阶段Ⅱ：加入2mL 组织消化液Ⅱ，37℃，摇床消化10-15min。镜下观察到大部分 细胞呈细胞团块（＜200μm）既可终止消化阶段Ⅱ（注：不要消化到单细胞状态）。 7. 终止消化阶段Ⅱ：加入8mL DPBS-PS终止消化，300g，离心5min，弃上清。 8. 收集细胞：加入10mL DPBS-PS对细胞进行重悬，使用2mL 抗粘附液预先湿润一个100 μm的细胞筛网，将细胞悬液使用该细胞筛网过滤，将滤出的滤液进行离心，300g， 5min，弃上清。 9. （可选步骤）如含较多红细胞（细胞沉淀呈现红色），加入红细胞裂解液进行裂红（具 体实验方法参考产品说明书）后，300 g，5 min，弃上清，使用1mL DPBS-PS重悬。 10. 计数：通过自动细胞计数仪或者手动计数板计出细胞的个数。计数后，300g，离心5 min，弃上清，收集细胞沉淀。 11. 接种：将获取的细胞沉淀，按照2-4*103细胞/μL的密度重悬于基质胶（BME或Matrigel） 中（接种密度仅供参考，可按照实验需求进行调整）。将基质胶重悬后的细胞接种至37℃ 预热的细胞培养板中，注意枪尖不要接种至培养板的底部，胶滴应接种于培养孔的中心 位置，若是24孔板，则每孔可接种50 μL。将接种好的培养板放置在37℃下静置5 min 后，倒置培养板静置25 min。 12. 补液：使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入600μL于37℃预热的类器官完全培 养基，请勿将培养基直接加到胶滴上。将1mL DPBS-PS均匀加至其它未接种液滴的孔中， 以保持培养时的湿度。 13. 培养：将培养板的盖子盖上，并在37℃和5％CO2下进行培养。镜下观察类器官的培养情 况，适时进行换液或传代（一般建议每2-3天进行全换液或半换液）。一般在接种3-4天 后，可观测到类器官形成。 猪来源肝类器官传代： 1. 传代标准：在传代前，确保大部分类器官的大小大于100μm。 2. 消化：将培养类器官的24孔板取出，用移液器去除培养基，每孔加入0.5mL TrypLE，使 用1 mL枪头将胶滴吹散（可根据类器官量适量增加TrypLE的体积）。室温消化5-8min， 或37℃培养箱消化5min（避免消化过度，影响类器官生长），显微镜下观察类器官消化 情况，待大部分类器官消化至40-60μm大小时，即可加入2倍消化液体积的DPBS-PS终 止消化。 3. 收集类器官：将消化后的类器官悬液转入离心管中（可用抗粘附液预先润湿离心管）， 保证培养孔中的类器官都被收集起来。300g，离心5min，去上清，收集类器官，使用 1mL DPBS-PS重悬。 4. 计数：通过自动细胞计数板或者手动计数板计出细胞的个数。计数后，300g，离心5 min，去上清，收集类器官。 5. 接种：将获取的类器官沉淀，根据计数结果重悬于基质胶（Matrigel）中，一个胶滴大 约需要200-500个细胞团（约2-5万个细胞）。吸取50μL细胞悬液，并加入到提前预热 的24孔板（提前预热半小时）的中心部位。（不要将类器官接种到最外侧的孔中。）将 接种好的培养板放置在37℃下静置5 min后，倒置培养板静置25 min，以待基质胶倒置 凝固。 6. 补液：使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入600μL于37℃预热的类器官完全培 养基，请勿将培养基直接加到胶滴上。将1mL DPBS-PS均匀加至其它未接种液滴的孔中， 以保持培养时的湿度。 7. 培养：盖上培养板板盖，并在37℃和5％CO2下进行培养。每2-4天进行一次全换液，观 察生长情况，并进行拍照记录，直至下次传代。 注：所有接触类器官的移液管、枪头等类器官培养耗材均需进行润洗，以免在传代过程 中出现样本的流失，使用抗粘附液效果更佳。 猪来源肝类器官冻存： 1. 冻存标准：观察类器官生长情况，当类器官活性良好，大部分类器官的大小大于100μm 时，即可进行冻存。 2. 消化：小心吸走培养孔中的培养基，每孔加入0.5mL TrypLE，吹散胶滴，37℃培养箱， 孵育3 min，显微镜下观察类器官消化情况，待类器官消化至40-60μm大小时，即可加入 2倍消化液体积的DPBS-PS终止消化。 3. 收集类器官：将消化后的类器官悬液转入离心管中（可用抗粘附液预先润湿离心管），保 证培养孔中的类器官都被收集起来。300g，离心5min，弃上清；加入3mL DPBS-PS重 悬细胞，300g，离心5 min，弃上清，使用1mL DPBS-PS重悬。 4. 计数：通过自动细胞计数板或者手动计数板计出细胞的个数。计数后，300g， 离心5 min，去上清，收集类器官。 5. 冻存：根据类器官计数结果，加入适量类器官冻存液重悬沉淀，混合均匀后分装至标记好 的冻存管中，类器官每管冻存细胞量约为5*105个，每管1mL，若细胞量较多时应注意分 管冻存；将冻存管置于程序降温盒中，-80℃过夜保存（或进行梯度降温，4℃放置 20min，-20℃放置2h，-80℃放置过夜），最后转移至液氮罐。 |
| 注意事项 | 1. 本产品仅供科研使用，使用前请仔细阅读本说明书。 2. 本产品仅适用于新鲜获取或在组织保存液中保存 24 h 内的新鲜标本。 3. 本产品培养结果会受到标本质量、培养条件等因素影响，同时也受到技术员操作习惯、操 作环境以及当前细胞生物学技术局限性等限制，因此可能会存在培养失败的情况。 4. 类器官完全培养基中不含有抗生素成分，请根据实验需求自行添加。 5. 建议进行适当分装，-20℃储存，开封后，4℃保存使用，并于 2 周内用完，避免反复冻 融。 |
| 声明 | 仅用于科研使用，不能用于临床诊断和治疗。 |
| 保存条件 | ’-20°C，12 个月 |
浙江百迪生物科技有限公司（简称“百迪科技”）成立于 2019 年，公司聚集于生物细胞培养领域。2023 年新百迪全面扩容，目前是国内首家集细胞培养区域三大产品管线——细胞、细胞培养试剂、耗材于一体的全领域产品生产制造商。百迪坚持自研自产，从源头开始，重视细节，严控质量，目标成为行业领先的卓越产品生产和服务商。
了解百迪动态，掌握最新科技资讯。如果您对我们的产品和服务感兴趣，或者希望了 解更多信息，请随时联系我们的客户服务团队。 我们期待与您合作，一同推动科研的辉煌未来。
400-601-2023
sales@biocode.cn
400-601-2023
sales@biocode.cn
